การโคลนยีน (gene cloning)

         การโคลนยีน

คำถามนำ

      การโคลนยีนคืออะไรและมีวิธีการอย่างไร

 

             การตัดและเชื่อมสายดีเอ็นเอเป็น DNA สายผสมนั้นไม่เพียงพอที่จะสามารถนำไปประยุกต์ใช้ได้ แต่ยังต้องมีวิธีการที่จะสามารถดำรง DNAสายผสมให้คงอยู่ และเพิ่มจำนวนเพื่อใช้ในการศึกษาว่า สาย DNA เหล่านั้นควบคุมการสร้างโปรตีนชนิดใดและศึกษาว่า DNA มียีนอะไรบ้าง สิ่งที่จำเป็นคือจะต้องเพิ่มจำนวน DNA ในบริเวณดังกล่าวให้มากพอที่จะศึกษาได้ การเพิ่มจำนวนของ DNA ที่เหมือนๆกัน นั้นเรียกว่า  การโคลนดีเอ็นเอ  (DNA cloning) และหาก DNA บริเวณดังกล่าวเป็นยีน ก็อาจเรียกว่า  การโคลนยีน  (gene cloning)

 

                18.2.1 การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรีย        การโคลนยีนวิธีหนึ่งที่เป็นที่นิยมกัน คือ อาศัยวิธีการเพิ่มจำนวนชุดของ DNA ในพลาสมิด (plasmid) ของแบคทีเรีย ซึ่งถือว่าเป็น  DNA พาหะ(vector) สำหรับการโคลน DNA อย่างหนึ่งในแบคทีเรีย 1 เซลล์ อาจมีพลาสมิด 1 ถึง 300 ชุด เมื่อนำเซลล์แบคทีเรียไปเลี้ยงเพื่อเพิ่มจำนวน ชุดของพลาสมิดก็เพิ่มขึ้นด้วย ซึ่งส่วนของ DNA ที่ต้องการแทรกไว้ในพลาสมิดก็จะเพิ่มขึ้นตามโดยปริยาย หากส่วนของ DNA ที่แทรกไว้เป็นยีนก็อาจนำไปใช้ประโยชน์ต่อไป

      ให้นักเรียนศึกษาภาพรวมของการโคลน DNA โดยอาศัยพลาสมิดจากแผนภาพต่อไปนี้


1. การแยกเม็กพลาสมิดที่จะนำมาใช้   2.  แทรกสาย DNA ที่มียีนที่ต้องการ  3.  นำพลาสมิดที่เป็นพาหะใส่ใน     4. โคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของ

   เป็นพาหะ  และ DNA                              ให้แก่พลาสมิดที่เป็นพาหะ                  เซลล์ของแบคทีเรียแบคทีเรีย          ไปเพาะเลี้ยงแล้วจากสิ่งมีชีวิต

                                                                                                                                       ที่เลี้ยง                                                   ให้พลาสมิดจำลองตัวเอง ในเซลล์ของแบคทีเรีย

ภาพที่ 18.2 การโคลน DNA  

 รู้รึเปล่า

     พลาสมิดเป็น DNA วงแหวนสายคู่ที่อยู่นอกโครโมโซมของแบคทีเรีย โดยธรรมชาติ อาจมีขนาดตั้งแต่ 1,000-200,000 คู่เบส พบได้ในเซลล์แบคทีเรียหลายชนิด มักมียีนที่สร้างเอนไซม์ที่จะทำให้แบคทีเรียมีลักษณะเฉพาะ

     พลาสมิดที่นิยมใช้ในการโคลนยีน ปัจจุบันได้พัฒนาให้มีขนาดเล็กประมาณ 3,000-4,000 คู่เบส มียีนต้านทานยาปฏิชีวนะเพื่อใช้เป็นเครื่องหมายในการคัดเลือกเซลล์แบคทีเรียที่มีพลาสมิด และมีตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะที่เหมาะต่อการแทรกสาย DNA ที่ต้องการเพื่อให้เกิดความสะดวกในการโคลนยีน

                     เพื่อให้เข้าใจการโคลน DNA และเทคนิคการสร้าง DNA สายผสม ให้นักเรียนทำกิจกรรมที่ 18.1

 

  กิจกรรมที่ 18.1 การโคลน DNA วัสดุอุปกรณ์       1.  กระดาษสีเขียวและสีแดง (หรือกระดาษที่มีสีต่างกัน)

       2.  ดินสอหรือปากกาเคมี

       3.  เทปใส

       4.  กรรไกร

       5.  ถุงทึบ

วิธีการทดลอง

           1.  ตัดกระดาษสีแดงให้มีขนาดกว้าง 3 cm และยาว 12 cm พร้อมทั้งเขียนลำดับ DNA ลงบนกระดาษสีแดง ไว้สำหรับเป็นสาย DNA ที่ต้องการตัดต่อเข้ากับพลาสมิด ทำให้จำนวน 10 ชิ้น

                                                  

            2.  ตัดกระดาษสีเขียวให้มีขนาดกว้าง 3 cm และยาว 20 cm พร้อมทั้งเขียนลำดับ เบส ลงบนกระดาษสีเขียวไว้สำหรับเป็นพลาสมิด ทำไว้จำนวน 10 ชิ้น

                                                  

            3.  นำกระดาษสีเขียวที่เป็นพลาสมิดแต่ละชิ้น ม้วนติดกันเป็นวงกลมด้วยเทปใส จะได้พลาสมิดทั้งหมด 10 ชิ้น

                                                                                       

              4.  ใช้กรรไกรตัดกระดาษสีแดงตรงตำแหน่งที่ตรงกับการตัดของเอนไซม์ตัดจำเพาะ Bam HI (ตารางที่ 18.1) ชิ้นส่วนที่แรเงาให้ตัดทิ้ง ส่วนที่เหลือคือ ชิ้น DNA ที่ต้องการต่อเข้ากับพลาสมิด ทำเช่นนี้ทั้ง 10 ชิ้น

                                                   

               5.  นำกระดาษสีเขียวที่เป็นพลาสมิด มาตัดตรงตำแหน่งที่เอนไซม์ตัดจำเพาะตัดตรงตำแหน่งเดียวกัน ซึ่งจะทำให้พลาสมิดขาดออกจากกันกลายเป็นสาย ทำเช่นนี้ทั้ง 10 ชิ้น

                                                                                    

       6.  นำกระดาษทั้ง 20 ชิ้น ใส่ลงในถุงทึบ เขย่าให้กระจายทั่ว แล้วหยิบชิ้นกระดาษทีละ 2 ชิ้น ออกจากถุง 10 ครั้ง

           -  ถ้าได้ชิ้นสีเขียว 1 ชิ้นและสีแดง 1 ชิ้น ให้นำกระดาษสีแดงซึ่งเป็นสาย DNA ที่ต้องการต่อเข้ากับพลาสมิดสีเขียว โดยเชื่อมกันเป็นวงด้วยเทปใส

          -  ถ้าได้ชิ้นสีเขียว 2 ชิ้น ให้ต่อพลาสมิด (กระดาษเขียว) ขดเป็นวงดังเดิมด้วยเทปใสซึ่งจะได้พลาสมิดสีเขียว 2 วง

         -  ถ้าได้ชิ้นสีแดง 2 ชิ้น ให้ต่อชิ้นสีแดงเข้าด้วยกันด้วยเทปใส

 

                  -  นักเรียนได้ DNA สายผสมในรูปของพลาสมิดที่มี DNA ที่ต้องการแทรกอยู่ทั้งหมดกี่วง

                  -  นักเรียนได้พลาสมิดที่เหมือนเดิมกี่วง

                  -  นักเรียนได้ DNA ที่ไม่ใช่พลาสมิดกี่โมเลกุล

                  -  ถ้ามีแบคทีเรียที่พร้อมรับพลาสมิดเข้าสู่เซลล์จำนวน 10 เซลล์ ถ้าโมเลกุล DNA จำลองที่นักเรียนสร้างขึ้นจะเข้าเซลล์ได้เพียง 1 โมเลกุล แล้วนักเรียนนำเซลล์ที่มีพลาสมิดที่มี DNA ที่ต้องการทั้ง 10 โมเลกุลที่สร้างขึ้น ไปเลี้ยงบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มียาปฏิชีวนะ ซึ่งพลาสมิดสีเขียวจะมียีนต้านทานยาปฏิชีวนะอยู่ แบคทีเรีย 1 เซลล์ที่เติบโตได้ จะกลายเป็นโคโลนีบนอาหาร เลี้ยงเชื้อ 1 โคโลนี นักเรียนคิดว่าบนอาหารเลี้ยงเชื้อของนักเรียนจะมีโคโลนีเกิดขึ้นกี่โคโลนี ทุกโคโลนีที่เกิดขึ้นมีส่วนของยีนที่ต้องการ (กระดาษสีแดง) แทรกอยู่หรือไม่

                  -  นักเรียนจะทราบได้อย่างไรว่า โคโลนีใดมีพลาสมิดที่มีส่วนของ DNA ที่ต้องการแทรกอยู่

 

                   18.2.2 การโคลนยีนในหลอดทดลองโดยเทคนิค พอลิเมอเรสเชนรีแอกชัน หรือพีซีอาร์

                   นอกจากการเพิ่มส่วนของ DNA โดยการแทรกส่วน DNA ดังกล่าวไว้ในพลาสมิดแล้ว ในปัจจุบันยังสามารถเพิ่มส่วนของ DNA ได้ในหลอดทดลองโดยไม่ต้องอาศัยเซลล์ใดๆอีกด้วย ในการใช้เทคนิคนี้ปัจจุบันอาศัยเครื่องมือที่เรียกว่า เทอร์มอไซเคลอร์(them cycler) ซึ่งเป็นเครื่องควบคุมอุณหภูมิให้ปรับเปลี่ยนตามกำหนดเวลาที่ตั้งไว้ เครื่องมือดังกล่าวนำมาใช้ในการโคลนยีนได้อย่างไร

                   ในการโคลนยีนโดยเทคนิค  พอลิเมอเรสเชนรีแอกชัน  (polymerase chain reaction; PCR) ต้องอาศัยเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรสชนิดพิเศษซึ่งสามารถทนอุณหภูมิสูงได้ เอนไซม์ชนิดนี้แยกมาจากแบคทีเรียทนร้อนซึ่งขึ้นอยู่ในน้ำพุร้อน

                ปฏิกิริยาในหลอดทดลองต้องใช้

       1.  DNA แม่แบบ ซึ่งเป็นส่วนของ DNA ที่ต้องการโคลน

       2.  ไพรเมอร์ (primer) เป็น DNA สายสั้นๆ ที่จะเกาะกับส่วนของ DNA ที่ต้องการ เพื่อเป็นจุดเริ่มต้นของการสร้างสาย DNA

       3.  นิวคลีโอไทด์ทั้ง 4 ชนิด

       4.  DNA พอลิเมอเรส

                   สารทั้งหมดนี้จะละลายอยู่ในสารละลายบัฟเฟอร์ เพื่อควบคุมให้เกิดภาวะที่เหมาะสมต่อการเกิดปฏิกิริยา การเกิดปฏิกิริยาในหลอดทดลอง (ภาพที่ 18-3) จะเริ่มจากการเพิ่มอุณหภูมิให้สูง จนสาย DNA แม่แบบที่เป็น DNA สายคู่แยกออกเป็น DNAสายเดี่ยว จากนั้นลดอุณหภูมิลงเพื่อให้เกิดการจับกันระหว่างไพรเมอร์ และสาย DNA แม่แบบด้วยพันธะไฮโดรเจน จากนั้นปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส เพื่อให้เกิดการจำลองสาย DNAโดยอาศัยสาร DNA แม่แบบ จากนั้นเพิ่มอุณหภูมิให้สูงขึ้นอีกครั้งเพื่อแยก DNA สายคู่ที่เกิดขึ้นในปฏิกิริยารอบที่ 1 ออกจากกัน แล้วดำเนินกิจกรรมเช่นเดิม ทำเช่นนี้ซ้ำหลายๆรอบ ก็จะได้โมเลกุลของส่วน DNA ที่ต้องการเป็นจำนวนมาก

 

ภาพที่ 18-3 การสร้างสาย DNA โดย พอลิเมอเรส เชน รีแอกชัน (PCR)  

                     เทคนิค PCR นี้ สามารถเพิ่มจำนวนโมเลกุล DNA ที่ต้องการจาก DNA แม่พิมพ์ปริมาณน้อย ให้มีปริมาณมากขึ้นได้ในเวลาอันรวดเร็ว แต่อย่างไรก็ดีเทคนิคนี้ไม่สามารถทดแทนการโคลนยีนโดยอาศัยเซลล์แบคทีเรียในกรณีที่ต้องการยีนปริมาณมาก รวมทั้งในกรณีที่ต้องการให้ยีนดังกล่าวเกิดการแสดงออก เช่น การสร้างโปรตีนที่ต้องการ นอกจากนี้การเพิ่มจำนวนชุดของ DNA ด้วยวิธีนี้อาจมีความผิดพลาดเกิดขึ้น เนื่องจากเอนไซม์ที่ใช้ในปฏิกิริยานี้บางชนิดไม่มีการทำงาน ที่เป็นการตรวจสอบความถูต้องของลำดับนิวคลีโอไทด์ของ DNA ที่สร้างขึ้นเหมือนกับระบบในสิ่งมีชีวิต

                     อย่างไรก็ดีได้มีกรนำเทคนิคนี้มาประยุกต์ใช้อย่างกว้างขวางตั้งแต่การโคลนยีนของตัวอย่างที่มี DNA ปริมาณน้อยให้มีปริมาณมากพอ แล้วจึงนำมาโคลนโดยอาศัยพลาสมิด เช่น การเพิ่มปริมาณ DNA จากซากของ  วอล-ลี่ แมมมอธ  (wolly mammoth) ซึ่งสูญพันธุ์แล้วแต่ถูกแช่แข็งไว้ที่ไซบีเรียเมื่อสี่หมื่นปีก่อน ทำให้มีโอกาสศึกษาเชิงปริมาณวิวัฒนาการในสิ่งมีชีวิตที่สูญพันธุ์ไปแล้ว การตรวจสอบ DNA ปริมาณน้อย ที่ติดอยู่ตามคราบเลือด เนื้อเยื่อ หรือน้ำอสุจิที่พบในอาชญากรรมต่างๆ ซึ่งเป็นประโยชน์ต่อการสืบสวนของกระบวนการยุติธรรม ตลอดจนการตรวจสอบ DNA จากเซลล์ของเอ็มบริโอในครรภ์ ว่ามีความผิดปกติทางพันธุกรรมหรือไม่ รวมทั้งตรวจสอบการติดเชื้อไวรัสบางชนิด เช่น HIV เป็นต้น